lncRNA cDNA鏈合成是高品質的基因結構和功能產品，由北京百奧萊博供應，本產品用于科研試驗，本產品質量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多lncRNA cDNA鏈合成等基因結構和功能產品請聯系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括lncRNA cDNA鏈合成試劑盒（去除基因組DNA)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：lncRNA cDNA鏈合成試劑盒（去除基因組DNA)
英文名稱：lncRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit （With gDNase)
產品貨號：WH0126
產品規格：20μl×25次|20μl×100次

本試劑盒是專門針對長鏈非編碼RNA （lncRNA)反轉錄而開發的產品。與mRNA相比，lncRNA具有豐度低、GC含量差異大、二級結構更復雜等特性，傳統反轉錄試劑對lncRNA難以達到理想的效果。本試劑盒含有去除基因組DNA的gDNase，通過42℃，3min即可去除RNA樣品中殘留的基因組DNA，可有效避免殘留的基因組DNA對后續PCR檢測結果的干擾。本試劑盒中lnR RT Enzyme Mix中使用的反轉錄酶為QuickKing RT Enzyme，此酶是通過分子改造后的反轉錄酶，特別增加了疏水motif，具有更強的RNA親和性和熱穩定性，從而進一步提高了其反轉錄效率和反應速率，42℃、15 min即可完成cDNA鏈的合成，且反轉錄長度至少可達10 kb。另外，酶與RNA親和力的更強，配合特殊優化過的緩沖體系和引物體系，使本試劑盒在通讀GC含量高，二級結構復雜，低豐度的RNA模板和抗逆性等方面表現突出，特別適合表達水平相對較低，二級結果相對復雜的lncRNA的反轉錄反應。

產品特點：
·性能：反轉錄效率可達95%以上，Total RNAzuì低檢測下限可達10ng，反轉錄長度可達10 kb以上。
·簡單快速：反應體系配制簡單，21 min完成lncRNA cDNA鏈的合成；
·適用廣泛：能夠通用于GC含量差異大，二級結構復雜，低豐度的RNA模板；對不同物種來源及雜質較多的RNA模板的適用性高；
·兼容性好：后續配合熒光定量檢測產品，靈敏度高、穩定性好。

試劑盒組成：

組分	25次	100次
5×gDNA Buffer	50μl	200 μl
lnR-RT Primer Mix	50μl	200 μl
lnR RT Enzyme Mix	25 μl	100 μl
10×lnR RT Buffer	50μl	200 μl
RNase-Free ddH2O	1ml	2×1ml

儲存條件：-20℃可保存一年。

注意事項：（請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。）
1．下列操作步驟適用于模板量為10ng-2μg的Total RNA，如果Total RNA量大于2μg，請按比例擴大反應體系。
2．在冰上進行操作，防止RNA發生降解。
3．對于二級結構很復雜的RNA模板，推薦使用變性步驟，即在操作步驟之前，將模板RNA在65℃孵育5 min后迅速轉移到冰上，然后再進行下一步操作。
4．根據實驗需求不同，也可以選用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，引物使用量：
  Oligo-dT Primer 50pmol/20 μl反應體系，
  Gene Specific Primer 5pmol/20 μl反應體系。
5．當PCR反應有非特異性擴增時，將反轉錄溫度升到50℃會有改善。

對RNA模板的要求：
反轉錄酶以RNA為模板合成鏈cDNA，模板RNA的質量和數量直接影響反轉錄的結果。

1．模板的完整性：模板RNA的完整性對反轉錄非常重要，若RNA模板中含有RNase酶將降解模板RNA，zuì后導致cDNA產物的量少甚至無cDNA產物。
2．模板的純度：若RNA模板中含有蛋白、鹽離子、EDTA、乙醇、酚等雜質，將影響反轉錄酶的活性，zuì后影響反轉錄結果。
3．模板的加量：上述操作步驟適用于模板RNA量為10ng-2μg，如果模板RNA的量大于2μg，請按比例擴大反應體系。

操作步驟：
10ng-2μg Total RNA可建立20 μl反應體系，具體過程如下所示：

1．將模板RNA在冰上解凍；5×gDNA Buffer、lnR-RT Primer Mix、10×lnR RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室溫（15-25℃）解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液渦旋振蕩混勻，簡短離心以收集殘留在管壁的液體。
  注意：以下操作步驟請在冰上進行。為了保證反應液配制的準確性，進行各項反應時，應先配制成Mix，然后再分裝到每個反應管中。
2．按照表1的基因組DNA的去除體系配制混合液，徹底混勻。簡短離心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
表1：gDNA去除反應體系

組分	用量	終濃度
Total RNA	10ng-2μg
5×gDNA Buffer	2 μl	1×
RNase-Free ddH2O	補至10μl

3．按照表2的反轉錄反應體系配制混合液。
表2：反轉錄反應體系

組分	用量	終濃度
10×lnR RT Buffer	2 μl	2×
lnR RT Enzyme Mix	1 μl	-
lnR-RT Primer Mix	2 μl	-
RNase-Free ddH2O	補足到10 μl	-

4．將反轉錄反應中的Mix加到gDNA去除步驟的反應液中，充分混勻后即完成20 μl反應體系。
5．42℃，孵育15 min。
6．95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后續實驗，或低溫保存。

注意：
1．若后續實驗為實時熒光定量PCR，反轉錄產物的加量應不超過PCR體系終體積的1/10，例如50μl的PCR反應體系，反轉錄產物的加量應不超過5 μl。
2．反轉錄結束后，請將反轉錄產物置于冰上，再進行后續PCR反應配制；如果需要長時間保存，請置于-20℃。

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貨號	名稱	規格
ZN0003	a-Fetoprotein mRNA原位雜交試劑盒	100T
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ZN0134	BMP-15 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0463	EPHA5 mRNA原位雜交試劑盒	100T
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名稱：Amelogenin/MAME mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0054
規格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：mouse
標記方式：3’—尾段標記
試劑盒中內容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預雜交液 2ml；
3.Amelogenin/MAME mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結果觀察：
Amelogenin/MAME的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。

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