一步法cDNA鏈合成試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品僅用于生物化學研究方面，本產品質量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多一步法cDNA鏈合成試劑盒等基因結構和功能產品請聯系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括一步法cDNA鏈合成試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：一步法cDNA鏈合成試劑盒
英文名稱：First cDNA Synthesis Kit（with gDNA Remover）
產品貨號：MT0015
產品規格：20μl×100次|20μl×2000次

本試劑盒采用穩定的反轉錄預混體系5×RT MasterMix進行RNA的反轉錄反應，使用時只需加入模板、引物和RNase Free H2O即可，大大簡化了操作過程、提高了效率、減少了操作過程中的人為誤差。MasterMix中添加了dsDNase（熱敏雙鏈特異性核酸酶），該雙鏈特異性核酸酶（又名gDNA Remover）可在反轉錄的過程中，直接降解去除RNA中殘留的基因組DNA污染(可去除100ng基因組DNA)，從而在定量PCR的檢測中無需考慮基因組污染的干擾，設計的定量PCR引物也無需進行橫跨外顯子。該試劑盒尤其適用于定量PCR檢測。

該預混體系包含點突變致RNase H活性缺失的反轉錄酶、dNTP、反應Buffer、gDNA去除試劑和RNase抑制劑。該試劑盒采用的反轉錄酶去除了RNase H活性，從而避免反轉錄過程中降解RNA。同時經過突變文庫篩選，使得其熱穩定性更強，可耐受55℃高溫反應。相比于低溫條件下反轉錄反應，采用高溫反轉錄可顯著打開RNA二級結構，從而提高復雜RNA模板的擴增性能、提高反轉錄cDNA的長度和產量，從而提高后續檢測的靈敏度。合成的鏈cDNA可廣泛用于2nd Strand的合成、雜交、PCR擴增、Real-Time PCR反應等。

特點：
1．dsDNase有效去除基因組的污染，抑制了因基因組污染引起的非特異性擴增。
2．55℃進行反轉錄的MLV反轉錄酶，能更好的轉錄含有復雜結構的RNA模板。
3．便捷的反轉錄預混體系。
4．反轉錄引物為Random Primer和Oligo dT Primer預混的RT Primer Mix，可更好的合成樣品中的各種cDNA。



產品組成：

組分	MT0015-100T	MT0015-2000T
5×RT MasterMix(with dsDNase)	400μl	8ml
20×Oligo dT(25)&Random Primer	100μl	2ml
Rnase-Free H2O	1ml×2	50ml

注：1．本試劑盒可有效反轉錄mRNA、tRNA、LncRNA、ncRNA。
  2．本試劑盒不可反轉錄microRNA、病毒DNA/RNA樣品。

保存條件：請置于-20℃，可保存2年；避免反復凍融。

使用方法：

1．按以下組分配制反轉錄反應液

Total RNA or Poly(A) RNA	0.1-2μg
5×RT MasterMix(with dsDNase)	4μl
*20×Oligo dT(25)&Random Primer	1μl
Rnase-Free H2O	Up to 20μl

*注：反轉錄引物可根據需要改用特異性引物。
2．在PCR儀上按以下條件進行反轉錄反應:
  37℃   10分鐘（去除gDNA）
  55℃   *30～60min（cDNA 合成）
  85℃   10分鐘（失活 MLV）
  4℃
*注：采用60min通?？梢垣@得更多的cDNA產物（100％產量），通常30分鐘也可以獲得足夠的cDNA產物（80％產量）。

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貨號	名稱	規格
ZN0006	ABCA1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0055	AMER1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0076	APEX1/Ref1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0089	ARG1 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0097	ASM mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0115	BACH1 mRNA原位雜交試劑盒	100T

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名稱：CHRM1 mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0288
規格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human,rat,mouse,rabbit
標記方式：3’—尾段標記
試劑盒中內容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預雜交液 2ml；
3.CHRM1 mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結果觀察：
CHRM1的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。

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