miRNA cDNA鏈合成試是高品質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應，本產(chǎn)品用于科研目的，本品質(zhì)量穩(wěn)定，價位合理，需要miRNA cDNA鏈合成試等基因結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)品的客戶，請到我公司官網(wǎng)聯(lián)系我們。...

特別提示：包括miRNA cDNA鏈合成試劑盒（加A尾法)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：miRNA cDNA鏈合成試劑盒（加A尾法)
英文名稱：miRNA First-Strand cDNA Kit
產(chǎn)品貨號：WH0131
產(chǎn)品規(guī)格：20μl×25次|20μl×50次

本試劑盒采用加A法來進行miRNA鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄。具體過程是先通過E.coli Poly（A) Polymerase在miRNA 3′末端加多聚A尾Poly（A)，再使用Oligo（dT)-Universal Tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應，zuì終生成miRNA對應的cDNA鏈。

本試劑盒采用了雙組分形式，簡化了實驗操作流程，降低了操作失誤的可能性。本產(chǎn)品中的miRNA RT Enzyme Mix包含了E.coli Poly（A)Polymerase、RTase和RNasin。其中的E.coli Poly（A) Polymerase不但具有的加A尾效率，還可特異性識別單鏈miRNA，從而避免了具有雙鏈結(jié)構(gòu)的miRNA前體的進一步逆轉(zhuǎn)錄反應；RTase經(jīng)過分子改造，去掉了RNase H活性，增加了RNA模板親和力，從而使得miRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應具有更高的效率和靈敏度。

本試劑盒中的2×miRNA RT Reaction Buffer包含了miRNA加A尾反應和逆轉(zhuǎn)錄反應的所有原料和引物，并經(jīng)過精心優(yōu)化，可保證miRNA 3′末端的Poly（A)修飾過程和逆轉(zhuǎn)錄過程同時進行。

本試劑盒須與miRNA熒光定量檢測試劑盒（WH0132)配套使用。

產(chǎn)品特點：
·省時省力：本試劑盒將miRAN的加A尾反應和逆轉(zhuǎn)錄反應合二為一，在減少操作步驟的同時也節(jié)省了一半的反應時間。另外，本試劑盒為雙組分形式，操作過程中只需加入RNA模板和兩個組分即可進行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應，進一步簡化了操作。
·特異性強：本試劑盒中的E.coli Poly（A) Polymerase和RTase都只針對單鏈的miRNA進行修飾和逆轉(zhuǎn)錄反應，因此可zuì大程度的避免具有二級結(jié)構(gòu)的miRNA前體進行逆轉(zhuǎn)錄反應。
·靈敏度高：本試劑盒通過將加A尾反應和逆轉(zhuǎn)錄反應的整合實現(xiàn)了miRNA的加A產(chǎn)物可全部進行進一步的逆轉(zhuǎn)錄反應，大大提高了低豐度miRNA的檢出率。
·適用廣泛：本試劑盒可針對幾乎所有材料提取的miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應，模板的使用范圍可達20pg~2μg（質(zhì)量范圍)和10 fM~100 pM （濃度范圍)。

試劑盒組成：

組分	20μl×25次	20μl×50次
miRNA RT Enzyme Mix	50μl	100 μl
2×miRNA RT Reaction Buffer	250μl	500 μl
RNase-Free ddH2O	1ml	1ml

儲存條件：-20℃下可保存1年。收到本產(chǎn)品后，請立即置于-20℃下保存。從-20℃取出使用時，將miRNA RT EnzymeMix需放在冰中備用；將凍存的2×miRNA RT Reaction Buffer融解，融解后輕輕顛倒混勻，待溶液完全均一后再行使用。

預防RNase污染，應注意以下幾方面：
1．經(jīng)常更換新手套。因為皮膚經(jīng)常帶有細菌，可能導致RNase污染。
2．使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
3．RNA在裂解液中不會被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。
4．配制溶液應使用無RNase的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1% （v/v)，放置過夜，高壓滅菌)。

操作步驟：
一、反轉(zhuǎn)錄體系的配制
解凍2×miRNA RT Reaction Buffer并混勻，miRNA RT Enzyme Mix放于冰中備用，在冰上預冷RNase Free的反應管內(nèi)加入以下試劑至總體積20 μl （zuì后加入miRNA RT Enzyme Mix)。

組分	使用量	終濃度
Total RNA*	可達2μg	-
2×miRNA RT Reaction Buffer	10 μl	1×
miRNA RT Enzyme Mix	2 μl	-
RNase-Free ddH2O	補至20 μl	-

*反應中所使用的Total RNA必須含有小分子RNA。此過程也可以使用小分子RNA作為模板，建議加入量為2-5 μl?？筛鶕?jù)目的miRNA豐度決定加入量，但是對于低豐度miRNA樣品而言（如血清血漿提取物)，可直接加入zuì大體積8 μl。

二、反轉(zhuǎn)錄程序
移液器輕輕混勻上述配制的反應液，按下表程序進行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應：

反應溫度	反應時間	說明
42℃	60 min	miRNA加A尾反應和逆轉(zhuǎn)錄反應
95℃	3 min	酶失活反應

合成的cDNA反應液可放置于-20℃保存；也可以直接進行下游熒光定量檢測。在進行下游熒光定量檢測時，為避免逆轉(zhuǎn)錄體系對定量PCR反應的抑制，得到zuì適的Ct值（15-30之間)，可將cDNA反應液稀釋10-1000倍后使用。

根據(jù)您的關注的miRNA cDNA鏈合成試劑盒（加A尾法)，您可能還對以下產(chǎn)品有需求：

貨號	名稱	規(guī)格
BTN111009	端粒酶重復片段擴增試劑盒(TRAP試劑盒)	50次
ZN0021	Activin A mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0033	Adora2b mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0349	CXCR3 mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0365	Cyclin H mRNA原位雜交試劑盒	100T
ZN0470	EPO mRNA原位雜交試劑盒	100T

關注miRNA cDNA鏈合成試劑盒（加A尾法)，的同時，為您推薦更多您可能感興趣的產(chǎn)品：



名稱：小鼠基因組DNA
貨號：BTN131033
規(guī)格：100μg
本產(chǎn)品為小鼠基因組DNA，是從無疾病小鼠全血中分離到的。利用脈沖電場凝膠電泳測量，90%以上的DNA的大小大于50kb。該DNA適用于Southern blot雜交,基因組分析(包括 PCR)及基因組文庫構(gòu)建等實驗。

儲存條件：低溫運輸、4℃保存、有效期一年。

名稱：ADRβ1 mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0037
規(guī)格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：rat
標記方式：3’—尾段標記
試劑盒中內(nèi)容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預雜交液 2ml；
3.ADRβ1 mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養(yǎng)細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎培養(yǎng)基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養(yǎng)細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調(diào)整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結(jié)果觀察：
ADRβ1的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數(shù)，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現(xiàn)非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現(xiàn)象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。

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