北京百奧萊博供應(yīng)的地高xīn標(biāo)記探針檢測試劑盒Ⅱ用于科學(xué)研究，我公司專注于探針標(biāo)記及檢測產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的地高xīn標(biāo)記探針檢測試劑盒Ⅱ質(zhì)量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括dì高辛標(biāo)記探針檢測試劑盒Ⅱ(AP)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：dì高辛標(biāo)記探針檢測試劑盒Ⅱ(AP)
產(chǎn)品貨號：ZN1517
產(chǎn)品規(guī)格：1盒

保存條件：-20℃冰凍保存。
保存期：一年
用途：用于 DNA 探針的隨機(jī)引物標(biāo)記及各種膜上雜交和原位雜交。
工作量：可用于 1000 張切片的原位雜交或12次 10×10cm 膜上雜交檢測。
原理：
所謂 DNA 探針，實質(zhì)上是一段已知的基因片段，應(yīng)用這一基因片段即可與待測樣品雜交。如果靶基因和探針的核苷酸序列互補(bǔ)，就可按堿基配對原則進(jìn)行核酸分子雜交，從而達(dá)到檢查樣品基因的目的。在隨機(jī)引物法標(biāo)記反應(yīng)液中，有隨機(jī)合成的六 聚 體 核 昔 酸(hexanucleotide)作 為引 物 ,dATP 、 dCTP 、 dGTP 、 dTTP和D1G-11-dUTP 作為合成底物，以單鏈 DNA 作為模板，在 Klenow 酶的作用下，合成摻入dì高辛的DNA 鏈。以dì高辛標(biāo)記的探針與靶基因 DNA 鏈雜交后，再通過免疫反應(yīng)來進(jìn)行檢測。一般通過酶標(biāo)抗dì高辛抗體來檢測，就可以肯定雜交反應(yīng)的存在。
免疫檢測一般用堿性磷酸酶系統(tǒng)，BC1P/NBT 顯色。敏感性很高。可用于膜上雜交和原位雜交。
試劑盒內(nèi)容：
1．Anti-DIG-AP Conjugate,100μl
2．BCIP/ NBT Stock Solution,1ml
3．Blocking Reagent,5g
特點：
(1)標(biāo)記屬標(biāo)記反應(yīng)。以 1μg DNA 探針為例，1 小時反應(yīng)即可產(chǎn)生 0.8μg標(biāo)記探針，20 小時可產(chǎn)生 2μg 左右的標(biāo)記探針。
(2)試劑將標(biāo)記反應(yīng)所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和 Klenow 酶等混合在一起。一次標(biāo)記只需吸取一次標(biāo)記液，使用至為簡便。
(3)標(biāo)記反應(yīng)適于下述對象：
a.DNA 從 10ng—3μg。
b.不等的DNA 長度 100bp—10kb。
c.線形排列或呈高度卷曲之 DNA。
d.低融點瓊脂中的DNA。
(4)檢測系統(tǒng)抗體為抗dì高辛單抗，標(biāo)記堿性磷酸酶。效價 1：5000(膜上雜交)或1：500(原位雜交)。
(5)顯色劑為BCIP/NBT，兩種成分混合后保存于 67%DMF 中，非常穩(wěn)定。用時 1：50 稀釋。
(6)試劑盒敏感性達(dá)到 0.1pg，足夠檢測出 1μg 基因組 DNA 中的單個基因。
(7)除用于各種膜上雜交之外，還可用于原位雜交(ISH)。
操作程序：
一 隨機(jī)引物標(biāo)記操作程序如下：
①用滅菌去離子蒸餾水稀釋 1μg DNA 至總體積 16μl。
②DNA 熱變性：把 DNA 瓶置于沸水中，水浴 10分鐘。然后，迅速地插入碎冰中 3分鐘以上。
③加 4μl DIG Random Labeling Mix(),混勻后再離心 2000/r.p.m×5分鐘。
④置 37℃反應(yīng)至少 120分鐘。時間越長，產(chǎn)量越高。延長反應(yīng)時間至 20 小時可明顯增加dì高辛標(biāo)記DNA的產(chǎn)量。應(yīng)根據(jù)需要控制反應(yīng)時間。
⑤加入 2μ 1 10mM EDTA 以中止反應(yīng)，對于原位雜交和膜上雜交反應(yīng)來說，標(biāo)記反應(yīng)可告結(jié)束，上述反應(yīng)液置-20℃保存至少一年以上。且可反復(fù)使用。
二 核酸探針膜上雜交原理和操作
(一)雜交總原則
脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵縮合成長鏈構(gòu)成 DNA的一級結(jié)構(gòu)。兩條堿基互補(bǔ)的多核苷酸鏈按堿基配對原則形成雙螺旋，構(gòu)成 DNA的二級結(jié)構(gòu)。某些條件(如酸堿、有機(jī)溶劑、加熱)可使氫鍵斷裂，DNA 雙鏈打開成單鏈重新結(jié)合。所謂雜交，是具有一定互補(bǔ)順序的核酸單鏈，DNA 單鏈仍然可與序列同源的單鏈按堿基互補(bǔ)原則結(jié)合成異源性雙鏈的過程。
(二)雜交膜的選擇
雜交膜可以選擇硝酸纖維素膜和尼龍膜。硝酸纖維膜的優(yōu)點在于本底較低，但只能用于顯色性檢測，且不能用于重復(fù)雜交。尼龍膜分為帶正電荷的膜和不帶電荷的膜兩種。帶正電荷的尼龍膜對核酸結(jié)合力強(qiáng)，敏感性也較高。不帶電荷的膜結(jié)合力低，相應(yīng)敏感性也較低。尼龍膜的優(yōu)點在于雜交用過的膜，用洗脫液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸 5-10分鐘后去除探針，可用于新的探針雜交。如果對雜交結(jié)果不滿意，如背景太高或顯色不強(qiáng)，也可洗去探針之后重新雜交。
(三)探針濃度
探針濃度是獲得理想雜交檢測的關(guān)鍵因素，濃度太高則會導(dǎo)致本底太深；若濃度太低又會導(dǎo)致信號減弱。為了解決過高探針濃度所引起的高背景，必須進(jìn)行模擬雜交實驗。
所謂模擬雜交實驗，即選擇幾小片雜交膜，在未轉(zhuǎn)移 DNA的情況下，進(jìn)行封閉、不同濃度的探針孵育及隨后的免疫檢測。以背景能被接受的zuì高探針濃度為正式雜交實驗的濃度。模擬雜交實驗不同濃度的探針可以參考下述方法配制：取 5μl 標(biāo)記反應(yīng)液加 1ml 探針稀釋液，混勻。取 0.5ml 等倍釋后，再取 0.5ml 繼續(xù)等倍稀釋。
假設(shè) 20μl 標(biāo)記反應(yīng)液中含 1μg 標(biāo)記的探針，則系列稀釋探針的濃度分別是：
200ng/ml、100nt/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。
(四)預(yù)雜交和雜交液
預(yù)雜交和雜交都使用相同緩沖液，不同的僅是預(yù)雜交液中不含有探針。下面是幾種基本雜交液配方：
① Standard buffer ：5 × SSC,0.1%(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
② Standard buffer+50% formamide∶50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。
③ High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodiμm Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine
(五)Southern Blotting 
DNA 片段經(jīng)電泳分離后按分子量大小排列在瓊脂糖凝膠上。1975 年 Southern 發(fā)明了利用濃鹽溶液的推動作用將變性的單鏈 DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的方法，解決了原位轉(zhuǎn)移的問題。雖然其原理和操作均很簡單，卻是基因分析中必不可少的手段，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。 Southern 印跡雜交包括兩個主要步驟①把電泳分級的DNA 轉(zhuǎn)移到固相支持膜上。②與標(biāo)記的DNA 探針雜交。
1．Southern 轉(zhuǎn)移
先將 DNA 用限制性內(nèi)切酶消化。準(zhǔn)備一定濃度的瓊脂凝膠。瓊脂凝膠必須是高純度和核酸級的。電泳后經(jīng)溴化乙錠染色并在紫外燈下照相后，將需要轉(zhuǎn)移的瓊脂糖凝膠切下，放入搪瓷盤中，然后進(jìn)行下面的步驟。
試劑
a.0.25M HC1
b.變性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1
c.中和液：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1
d.20×SSC：0.3M 檸檬酸鈉,3M Nac1。
e.2×SSC：0.03M 檸檬酸鈉,0.3M Nac1。
程序：
(1)將膠浸入 0.25M HC1 中 10分鐘。HC1 處理的作用主要是通過去嘌呤使 DNA分子斷裂，因而有利于高分子量 DNA的轉(zhuǎn)移，但不能處理時間過長。要轉(zhuǎn)移全部小于 10kb的DNA 片段時可省略此步驟。
(2)進(jìn)入變性液之前，用蒸餾水漂洗20-30分鐘。
(3)把膠浸入變性液中，室溫浸泡 15分鐘×2次。
(4)蒸餾水漂洗凝膠 2次。
(5)把膠浸入中和液中，室溫泡 15分鐘×2次。
(6)在處理凝膠的同時，切一張與膠同樣大小的尼龍膜或硝酸纖維膜。硝酸纖維膜用 2×SSC 浸泡。
剪兩張 Whatman3#濾紙和一疊吸水用的粗濾紙注意不能用手指直接觸及膜面。
(7)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移用平器和支架，平器中放 20×SSC。架子上搭濾紙橋使溶液能夠虹吸上來。
(8)依次放：處理好的凝膠，硝酸纖維素膜，吸水濾紙，玻璃板，適量重物(500-1000g)
(9)注意：要檢查 PH 值，用硝纖膜時 PH<9。要確保各層間沒有氣泡，否則會發(fā)生局部“緣”，氣泡處的DNA 難以被吸到硝酸纖維膜上。
(9)于室溫轉(zhuǎn)移 12-20 小時。
(10)取出轉(zhuǎn)移膜，用 2×SSC 漂洗數(shù)次，以去掉可能粘附于膜上的凝膠。
(11)固定：可選擇下述方法之一進(jìn)行 DNA 固定
·紫外線固定：使用長波紫外線照射 10-20分鐘，簡單漂洗后干燥備用。
·尼龍膜置+120℃烘烤 30分鐘。
·硝纖膜置真空烤箱中，80℃減壓烘烤 2-2.5 小時，以避免硝纖膜自熔。若無真空烤箱，
亦可在普通烤箱中 65-70℃烘烤 3-4 小時，也能達(dá)到固定目的。固定后，將膜封于塑料袋中，保存于干燥處待雜交。
注意事項：
①轉(zhuǎn)移液的鹽濃度對轉(zhuǎn)移具有一定影響。一般選擇 20×SSC 快速轉(zhuǎn)移。
10×SSC 轉(zhuǎn)移速度較慢，對于高分子量 DNA(〉10Kb)效果比較理想。因此要根據(jù)不同目的選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移液。
②轉(zhuǎn)移時不能移動上邊重物，防止出現(xiàn)“重影”現(xiàn)象。
③硝酸纖維膜對于 0.5kb 以下的小分子 DNA 結(jié)合不牢，轉(zhuǎn)移時容易丟掉。要探測小片時zuì好用尼龍膜。

2 ．Southern 印跡雜交雜交成功的關(guān)鍵因素之一在于選擇雜交液。應(yīng)通過預(yù)實驗來選擇合適的雜交液。另一個比較重要的因素是標(biāo)記探針的濃度，一般選擇 5-25ng/ml，應(yīng)通過模擬雜交實驗來選擇合適的探針濃度。
試劑
a.Standard buffer
b.Standard buffer+50% formamide
c.High SDS buffer
d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS
e.Wash Solution Ⅱ:0.5XSSC,0.1%SDS
程序
①將轉(zhuǎn)移好的尼龍膜或硝纖膜裝入塑料袋中，每邊各留 2-4mm 空隙。灌注雜交液的一邊留 1cm 空隙。在角上剪開一個小口，灌注預(yù)雜交液，從切口處趕走氣泡，用封膜機(jī)封口，浸入水浴中。
②根據(jù)所選擇的不同預(yù)雜交液，采用不同的溫度預(yù)雜交 4-20 小時：Standard buffer:
預(yù)雜交溫度 65-68℃ ,Standard buffer+50% formamide:37-42℃ ,High SDS buffer:37-42℃。
③使用雙鏈 DNA 探針時，沸水浴 10分鐘以變性探針。然后迅速插入冰中。
按模擬雜交實驗所確定的探針濃度將適量探針加入到預(yù)雜交液中，配成雜交液，一般濃度 5-25ng/ml。按每100cm2 膜加入至少 3.5ml 配制雜交液。
④使用和預(yù)雜交相同的雜交溫度，一般雜交 16-20 小時。
⑤雜交結(jié)束后，取出雜交袋，剪開一個小口，將雜交液倒入帶蓋的試管中，儲存于-20℃以備下次使用。這樣至少可保存一年。再次使用之前應(yīng)在凍融之后，加熱至+95℃
10分鐘以變性探針。雜交液如含有 50%甲酰胺，則在 68℃變性 10分鐘即可。
⑥取出雜交膜，用 Wash Solution I洗5分鐘×3次。
⑦保溫沖洗：用 Wash SolutionⅡ于 68℃沖洗15分鐘×2次。
(六)· DNA Dot Blotting 
此檢測方法用于快速定性篩選 DNA。樣品可以是純化 DNA，也可以是細(xì)胞碎片 PCR擴(kuò)的DNA。預(yù)雜交和雜交方法與 Southern 基本一致，不同的僅是樣品的處理不同。
試劑：DNA dilution buffer∶10mM Tris-HC1；1mM EDTA,PH8.0；50μg/ml herring Sperm DNA
程序：
①將樣本 DNA 稀釋成不同濃度。
②將樣本 DNA 于+95℃水浴 10分鐘，迅速插入冰中。
③取 1μl 點樣至尼龍膜或硝纖膜上。點樣前先畫上圓卷做記號。
④用紫外線照射固定或+120℃烘烤 30分鐘固定。
其后雜交步驟 Southern 相同
(七)BCIP/NBT 顯色檢測法
試劑：a.Anti-DIG-AP 堿性磷酸酶標(biāo)記抗dì高辛單抗體。
b.BC1P/NBT 儲備液：
c.沖洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1,PH7.4。
d.封閉液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。
e.顯色緩沖液：0.1M Tris-Hcl,0.1M,Nacl,PH9.5。
f.TE 緩沖液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0
程序：
①經(jīng)過雜交及雜交后的沖洗之后，膜置于沖洗液中平衡 1分鐘。
②用干凈的雜交袋或平皿，封閉液室溫封閉至少 60分鐘。
③用封閉液(d)1：2500—5000 稀釋 Anti-DIG-AP，例如 2μl Anti-DIG-AP 加至 5—10ml封閉液中(根據(jù)染色情況而調(diào)整)。稀釋液+4℃可穩(wěn)定 12小時左右。
④加 Anti-DIG-AP，37℃反應(yīng) 60分鐘。
⑤用沖洗液沖洗15分鐘×3次，每次 100ml。
⑥按 1：50 配制底物顯色液：例如 100μl“BCIP/NBT 儲備液”(b)加至 5ml 顯色緩沖液中，未用完的顯色劑應(yīng)避光保存。
⑦顯色緩沖液 20ml 平衡 2分鐘后傾掉。
⑧加 10ml 底物顯色液(100 cm2)。將膜及顯色劑封在塑料袋中，開始避光顯色。顯色過程中可以觀察。一般數(shù)分鐘即開始出顏色，顯色過程可以持續(xù)至 12 小時。應(yīng)避免振動，以免出現(xiàn)顯色帶的移位。
⑨當(dāng)所需要的顯色點或帶出現(xiàn)之后，蒸餾水洗以中止反應(yīng)。結(jié)果可以進(jìn)行照相記錄；也可以直接保存于 TE 緩沖液(f)，在此情況下，顏色長期不退。還有一種選擇是讓膜干燥，顏色消退。但若將膜放置于 TE 緩沖液中，顯色重新出現(xiàn)。
三 原位雜交
所謂原位雜交是指在保存染色體、細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)的前提下，用探針定位檢查出相關(guān)基因序列。結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)，原位雜交可以揭示出基因在 DNA、mRNA 水平的表達(dá)。
原位雜交技術(shù)zuì早 Pardue and Gall和 John etal。分別在 1969 年發(fā)現(xiàn)。zuì初，放射性標(biāo)記技術(shù)是的方法，其使用受到明顯限制。由于非放射性標(biāo)記技術(shù)的簡單、高敏感性，為原位雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用開避了道路。
(一)染色體原位雜交的一般技術(shù)
1 玻片準(zhǔn)備
為了展開染色體，酒精清潔玻片即可。但為了防止細(xì)胞和組織的脫落，必須用多聚賴氨酸或APES 處理玻片。
2 固定
為了保存形態(tài)結(jié)構(gòu)，生物材料都必須予以固定。染色體的固定比較簡單，甲醇/乙酸固定即已足夠。如果是石蠟包埋組織，采用福爾馬林固定。冰凍切片采用 4%甲醛或Bouin"s 固定液固定 30分鐘。應(yīng)予注意的是，DNA和 RNA 雖然不和各種交聯(lián)劑反應(yīng)。但包圍 DNA.RNA的各種蛋白質(zhì)和交聯(lián)劑反應(yīng)后，就會遮蓋住靶核苷酸。因此，必須采取各種增加通透性的程序。
3 玻片上材料的預(yù)處理
a．內(nèi)源性酶的滅活
如果用酶作為標(biāo)記物，內(nèi)源性酶必須預(yù)先予滅活。如過氧化物酶，可用 1%H2O2/甲醇 30分鐘處理。至于堿性磷酸酶，由于雜交過程的破壞，殘余堿性磷酸酶的活力會完全消失。
b.RNA 酶的處理—DNA-DNA 雜交時需要處理內(nèi)源性 RNA。
內(nèi)源性 RNA的存在，會由于 DNA-RNA的雜交而增加背景。處理方法：DNase-free RAase(100μg/ml)/2×SSC,37℃孵育60分鐘。(SSC=150mM Nac1,15mM Sodiμm Citrate,PH7.4)
c.HC1處理用 200mM HC1處理 20-30分鐘可以增加信/噪比值，其機(jī)理尚不清楚。
可能與蛋白的抽提和部分功能核苷酸片斷的溶解有關(guān)。
d.去垢劑處理
在脂膜成分未被固定，脫水、包埋等程序抽提時，可以進(jìn)一步使用去垢劑處理，如Triton X-100,Sodiμm dodecyl Sulfate 等，同樣有助于原位雜交技術(shù)。
e.蛋白酶消化
蛋白酶消化有助于增進(jìn)探針和核苷酸之間的接觸性。消化通常用蛋白酶K，溶于20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37℃ 15-30分鐘。蛋白酶 K 濃度依不同對象來確定。
例如對染色體和核的分離部分，可以用 1μg/ml 蛋白酶 K。
4 探針和靶基因的變性
對染色體 DNA的原位雜交，必需進(jìn)行變性處理。熱變性越來越常用，它不僅簡單，而且效果很好。對不同的雜交，應(yīng)試驗不同的時間和溫度，以找到zuì佳的變性條件。
熱變性時，探針和靶基因可以同時變性。將探針加到玻片上，蓋上蓋玻片。玻片放到 80℃，2分鐘后取出冷卻至 37℃。如果是組織切片，變性時間應(yīng)達(dá)到 80℃10分鐘
5 雜交后的沖洗
標(biāo)記探針能夠和其序列具有部分同源性的基因非特異性的雜交。這類雜交分子的穩(wěn)定性總是不及完全同源的雜交分子。分別用不同強(qiáng)度沖洗液可以有效地洗掉非特異雜交的/探針，而保留特異雜交的探針。沖洗液的強(qiáng)度可通過改變甲酰胺濃度、鹽濃度和溫度來控制。通常用 2×SSC＋50%甲酰胺來沖洗。有時可用更高強(qiáng)度的沖洗液。
總的來說，雜交時用高強(qiáng)度緩沖液，沖洗時用低強(qiáng)度的沖洗液(鹽濃度越低，甲酰胺濃度越高和溫度越高，則沖洗強(qiáng)度越大)。
6 免疫細(xì)胞化學(xué)
免疫細(xì)胞化學(xué)和常規(guī)方法一樣，必須行非特異性的封閉處理。如探針為dì高辛標(biāo)記時，Tris-HC1 緩沖液含“Blocking Reagent”。此外 0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。在標(biāo)準(zhǔn)的免疫反應(yīng)程序中，先對染色體、細(xì)胞和組織進(jìn)行封閉，然后用酶標(biāo)抗體 37℃反應(yīng) 30分鐘(或室溫 1-2 小時)。此后用含 Tween 20的緩沖液進(jìn)行三次沖洗每次 5-10分鐘。免疫細(xì)胞化學(xué)中zuì常用的酶是過氧化物酶和堿性磷酸酶。
前者用 DAB 作顯色劑。后者用 BCIP/NBT 作顯色劑，方法同膜上雜交。顯色強(qiáng)度由顯微鏡下控制。
7 影響原位雜交的主要因素
a.探針長度：原位雜交和其它雜交方法不同，它要求較短的探針。因為探針越短，滲透性越強(qiáng)，可以滲透至細(xì)胞內(nèi)部和染色體。不同的雜交所允許的zuì小核苷酸如下述公式所計算：
b.探針濃度：濃度越高，則雜交速度越快。但過高的濃度也會使背景增加，因此，宜選擇可接受背景的zuì高探針濃度。
c.硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物質(zhì)，因此使得大分子(如探針)難以接觸到其結(jié)合水，相對濃度大大增加，雜交速度明顯加快。
d.堿基錯配：堿基錯配會引起雜交速度及二倍體的穩(wěn)定性下降。因此在嚴(yán)格的雜交條件下，可以阻止探針與靶基因的非特異結(jié)合。
e.沖洗條件
8 雜交標(biāo)準(zhǔn)條件
適于 DNA 探針＞100bp
⊙50%去離子甲酰胺
⊙2×SSC
⊙50mM NaH2PO4/Na2HPO4,PH7.0
⊙1mM EDTA
⊙載體 DNA：鮭角精子 DNA 100-250ng/μl。
任選組合：
1×Denhardt`s
dextran sulfate,1-10%
溫度 37-42℃
雜交時間：5-16 小時
(二)組織切片的原位雜交
目前，原位雜交已成病理學(xué)的一個有力工具，原位雜交可以用于諸如病毒，癌基因，基因突變等領(lǐng)域的檢查。尤其是非放射性標(biāo)記探針技術(shù)，為更多的實驗室廣泛應(yīng)用原位雜交創(chuàng)造了條件。對福爾馬林固定、石蠟包埋切片的原位雜交，關(guān)鍵是以下三個步驟：
①靶 DNA的暴露。這要靠精心設(shè)計的消化步驟。
②DNA的變性和雜交。
③雜交的分子的沖洗和檢測。
1 探針的準(zhǔn)備
2 玻片的處理
①去污劑浸泡一晚，大量自來水沖洗，然后用蒸留水清洗。
②干燥之后，浸入丙酮中 3分鐘。
③玻片移入 1：50 丙酮稀釋的APES 溶液中，浸泡 5分鐘。
④玻片用蒸餾水略加清洗。干燥備用。處理后的玻片置干燥無塵環(huán)境可保存半年。
玻片也可用“多聚賴氨酸”處理。
3 組織切片的準(zhǔn)備
①組織用常規(guī) 4%中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋。
②常規(guī)切片。切片撈于涂有粘片劑的玻片上。
③切片處理：先置 60℃烘片 30分鐘。
二甲苯脫蠟，逐級酒精至水清洗。
④臨用前配制蛋白酶 K 溶液：
儲備液：Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋-20℃保存。將儲備液用 TES 稀釋成100μg/ml。(TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4)
⑤每張切片用 Proteinase k 20-30μl 37℃消化 15分鐘。消化過程中加蓋硅化蓋玻片，并置濕盒中。注意消化對組織原位雜交是至關(guān)重要的。過度消化會導(dǎo)致切片消失殆盡，消化不足則敏感性不夠，因此應(yīng)針對不同組織嘗試不同的消化條件。
4 雜交
①蛋白 K 消化后，去除蓋玻片。用 4%甲醛 4℃固定 5分鐘。
②蒸餾水洗5分鐘。
③讓切片上水分滴下去，并在室溫干燥 5分鐘。注意只能讓切片上水份減少，不能讓切片完全干燥。④每張切片加 5-10μl 探針(大切片需相應(yīng)增加)。
⑤設(shè)立嚴(yán)格的對照組，每張切片加 5-10μl不加探針的雜交液。
⑥切片上加硅化蓋玻片，將玻片置+95℃變性6分鐘。
⑦把玻片放到冰上 1分鐘。
⑧切片置溫盒，42℃雜交3小時以上。如果方便，應(yīng)雜交過夜。
5 沖洗
去掉蓋玻片，按下述程序沖洗
2×SSC洗5分鐘×2次(室溫)
0．1×SSC洗10分鐘(42℃)
6 雜交分子的檢測---BCIP/NBT
①切片置于 0．1M TBS 緩沖液中，PH7．4
②每張切片加 20-40μl 封閉液：0．5%Blocking Reagont/0.1M TBS。
③室溫反應(yīng) 15分鐘。
⑤用封閉液 1：500 稀釋 Anti-DIG-AP；(臨用之前才配，配好后立即加至切片)
⑥每張切片加 20-50μl 稀釋試劑，濕盒室溫反應(yīng) 1-2 小時。
⑦用 0．1M TBS洗10分鐘×3次
⑧用 0．2M Tris-HC1,10mM MgC12,PH9.2 平衡5分鐘。
⑨配顯色劑：將 BCIP/NBT 儲備液用上述緩沖液 1：50稀釋。每張切片加20μl，置黑暗處顯色。顯色快時，一般30-60分鐘。信號弱時顯色過夜。
(三)細(xì)胞的原位雜交
下面的程序是用標(biāo)記DNA 探針來檢測培養(yǎng)細(xì)胞中的mRNA。其它類型的檢測可以參照此程序進(jìn)行。
1 細(xì)胞準(zhǔn)備，固定和增加通透性
注意：所有溶液都必須用 RNase 抑制劑處理。
①玻片用多聚賴氨酸處理。直接用 5% CO2 在玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。所用培養(yǎng)基為無酚紅 Dulbecco"s 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
②37℃PBS 清洗細(xì)胞。然后用下述固定液室溫固定 30分鐘：4%甲醛，5%乙酸和0．9%NaC1。③室溫 PBS 清洗固定細(xì)胞，用 70%乙醇儲存于 4℃④雜交前用下述方法脫水：
70%，90%和 乙醇；10%二甲苯；然后再用 ，90%，70%乙醇，zuì后 PBS洗二次。
⑤用胃蛋白酶消化細(xì)胞：0.1%Pepsin/0.1N HC1,37℃5-10分鐘。
⑥PBS洗5分鐘后，1%甲醛固定 10分鐘。PBS洗。
2 雜交
①dì高辛標(biāo)記探針。
②雜交液配制：60%去離心甲酰胺，0．3M NaC1，30mM檸檬酸三鈉，10mM EDTA，25mM Na2HPO4(PH7.4)，5%硫酸萄聚糖，250ng/μl鮭角精子 DNA。
③于80℃10分鐘變性標(biāo)記探針，然后加至上述雜交液中，濃度為5ng/μl
④加 10μl雜交液至玻片上，并蓋上蓋玻片。注意：也可選擇原位變性步驟，這樣可增加 RNA和探針的接觸性。
⑤37℃雜交16小時。
3洗滌
雜交后去掉蓋玻片，于下述溶液中充分洗滌：60%甲酰胺，300mM NaCl，30mM 檸檬酸鈉。室溫洗三次，37℃洗一次。然后 PBS洗5分鐘。
4 免疫檢測
①用下述緩沖液作非特異性的封閉：0．5%Blocking Reagent/0.1M TBS，加蓋玻片。
室溫 15分鐘。②用封閉液 1：500 稀釋 Anti-DIG-AP(臨用之前才配，配好后立即加至切片)。
③每張切片加 20-50μl 稀釋酶標(biāo)試劑，置濕盒室溫反應(yīng) 1-2小時。
④用 0．1M TBS洗10分鐘×3次。
⑤用 0．1M Tris-HC1．0．1M Nac1，50mM Mgc12，PH9.5 平衡約 5分鐘。
⑥顯色劑配制：將 BC1P/NBT 儲備液用上述緩沖液 1：50 稀釋。每張切片加 20μl，置黑暗處顯色，一般顯色 30-60分鐘。信號弱時顯色過夜。

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名稱：生物素標(biāo)記dUTP溶液(Biotin-11-dUTP)
貨號：BTN100920
規(guī)格：50μL
本產(chǎn)品是濃度為1mM的Biotin-11-dUTP。分子式：C28H41N6O17P3SNa3，分子量：927.6。分子結(jié)構(gòu)式圖如下：

Biotin-11-dUTP常用于PCR、缺口平移、cDNA合成、隨機(jī)引物標(biāo)記和引物延伸等方法標(biāo)記DNA。

儲存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期兩年。

名稱：生物素標(biāo)記UTP溶液(Biotin-16-UTP )
貨號：BTN151203
規(guī)格：25μL

名稱：BLOTTO溶液
貨號：BTN100812
規(guī)格：250mL
BLOTTO全名是Bovine Lacto TransferTechnique Optimizer，是一種含有脫脂奶粉、磷酸鹽和抗菌劑的雜交阻斷劑，可以用于DNA雜交(Southern雜交、斑點雜交、菌落雜交)、Western雜交、ELISA；但不能用于RNA雜交和低拷貝的Southern雜交。也不能與含高濃度的SDS混用。

儲存條件：低溫運(yùn)輸、-4℃保存(不能保存在-20℃)，有效期一年。

名稱：鮭魚精DNA溶液
貨號：BTN100604
規(guī)格：1mL
本產(chǎn)品是濃度為10mg/mL的、經(jīng)過熱變性處理的單鏈鮭魚精DNA溶液，可以用于Southern、Northern預(yù)雜交，還可以用于酵母化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化。本產(chǎn)品即開即用，非常方便。

儲存條件：低溫運(yùn)輸和-20℃保存、有效期一年。

名稱：化學(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測試劑盒
貨號：YT032
規(guī)格：1000cm2
本試劑盒是一種通過Streptavidin-HRP及后續(xù)的ECL試劑來實現(xiàn)化學(xué)發(fā)光檢測Biotin標(biāo)記核酸的檢測試劑盒。適用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay (RPA)或EMSA等實驗中，采用生物素標(biāo)記的DNA或RNA探針時的檢測。本試劑盒不適用于生物素標(biāo)記蛋白的檢測。

本試劑盒采用了高質(zhì)量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共價交聯(lián)的比例大于3，這樣比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate兩種試劑進(jìn)行檢測要更方便，并且靈敏度更高。采用了非特異性結(jié)合比avidin更低的strepatavidin，使檢測結(jié)果背景更低靈敏度更高。

本試劑盒沒有提供生物素探針標(biāo)記相關(guān)的試劑，生物素標(biāo)記的DNA探針或EMSA探針的制備可以相應(yīng)地使用百奧萊博的生物素標(biāo)記DNA試劑盒（TdT加尾法）或EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒(YT189)。本試劑盒可以用于檢測至少10塊10 x 10cm有生物素標(biāo)記EMSA探針的膜，即共1000cm2。

試劑盒組份：

ECL A液	55ml
ECL B液	55ml
Streptavidin-HRP Conjugate	100μl
封閉液	380ml
洗滌液(5X)	250ml
檢測平衡液	250ml

儲存條件：-20℃。

使用說明：
1. 在使用Biotin標(biāo)記探針的情況下，完成Southern、Northern雜交及后續(xù)洗滌后，或RPA的轉(zhuǎn)膜和交聯(lián)后，或EMSA的轉(zhuǎn)膜和交聯(lián)后，可以使用本試劑盒開始檢測。下面的檢測過程中溶液的用量是用于一片10x10cm膜的量。如果膜較大或較小，各溶液的用量可以按比例放大或縮小。
2. 37-50oC水浴溶解封閉液和洗滌液。
注意：封閉液和洗滌液必須完全溶解后方可使用，封閉液和洗滌液可以在室溫至50oC之間使用，但必須確保這兩種溶液中均無沉淀產(chǎn)生，在冬天需特別注意。
3. 取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯(lián)過的含有樣品的尼龍膜。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
4. 取7.5μl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:2000稀釋)，混勻備用。
5. 去除封閉液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。
6. 取25ml 洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ級純水，混勻配制成125ml洗滌液。
7. 將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內(nèi)，漂洗1分鐘。
8. 去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側(cè)擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鐘。
9. 重復(fù)步驟8三次(共洗滌四次)，每次洗滌時間均約為5分鐘。
10. 將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有20-25ml檢測平衡液的容器內(nèi)，在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動5分鐘。
11. 取5ml ECL A液和5ml ECL B液混勻，配制成ECL工作液。注意：ECL工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。說明：從本步驟起操作方法和注意事項同Western實驗的熒光檢測。
12. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處于水平桌面上的潔凈容器內(nèi)或保鮮膜上。
13. 在尼龍膜的表面小心加上步驟11配制好的共10ml ECL工作液，使工作液完全覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鐘。
14. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當(dāng)?shù)耐腹獗∧ぶ虚g，并固定于壓片暗盒(也稱片夾)內(nèi)。
15. 用X光片壓片1-5分鐘。可以先壓片1分鐘，立即顯影定影，然后根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鐘或更長時間，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。

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