冠狀病毒/博卡病毒雙重熒光PCR是高品質的病毒PCR檢測試劑盒產品，由北京百奧萊博供應，本產品用于科學研究，本品質量穩(wěn)定，價位合理，需要冠狀病毒/博卡病毒雙重熒光PCR等病毒PCR檢測試劑盒產品的客戶，請到我公司官網聯(lián)系我們。...

特別提示：包括冠狀病毒/博卡病毒雙重熒光PCR檢測試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產品名稱：冠狀病毒/博卡病毒雙重熒光PCR檢測試劑盒
產品貨號：SYA190
產品規(guī)格：48次/盒

一、簡介：
本試劑盒用一對冠狀病毒型特異性引物，一對博卡病毒型特異性引物，分別結合一條特異性熒光探針，用一步法雙重熒光RT-PCR 技術對冠狀病毒/博卡病毒RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。本試劑盒中冠狀病毒型的探針報告基團為FAM，博卡病毒型的探針報告基團為VIC/HEX/JOE。

二、用途：
本試劑盒適用于各種咽拭子、鼻拭子樣品等臨床樣品中冠狀病毒/博卡病毒的特異性檢測。適用于冠狀病毒/博卡病毒感染的輔助診斷、監(jiān)測及流行病學調查，其檢測結果僅供臨床參考。

三、試劑盒組成：(48T)
組份 數量 規(guī)格
冠狀病毒/博卡病毒反應液(HCOV/HBocaV-qRT-PCR MIX) 1管 576μL/管
qRT 酶混合物(qRT Enzymes MIX) 1管 192μL/管
無核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
陰性對照(NTC) 1管 50μL/管
冠狀病毒/博卡病毒陽性對照(HCOV/HBocaV-PTC) 1管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。

六、樣品的采集與RNA提取
6.1 樣品的采集
按照相關標準采集。標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-80℃，但不能超過6個月，標本運送應采用0℃冰壺。
6.1.1 血清：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入無菌的干燥玻璃管，室溫(22-25℃)放置30-60min，血標本可自發(fā)完成凝集析出血清，或直接使用水平離心機，3000rpm離心5min，吸取上層血清，轉移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.2 血漿：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二鈉)或檸檬酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，5-10min后即可分離出血漿，轉移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.3 拭子、分泌物等樣品：在裝有拭子或分泌物的離心管中加入500μL PBS或生理鹽水，劇烈振蕩30s。棉拭子盡量擠出液體轉移到無RNA酶污染的離心管中，6000rpm離心20s，取上清備用。
6.1.4 病灶組織樣品：稱取組織約0.1g于研磨器或組織勻漿器中研磨(zuì好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理鹽水研磨至無塊狀物，然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液于1.5mL滅菌離心管中。
6.2 RNA提取
可采購北京百奧萊博科技有限公司生產的RNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
 注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取4μL 加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR 反應液(HCOV/HBocaV-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm 離心10s。
設所需要的PCR 反應管管數為N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 12μL N×12μL
酶混合物 4μL N×4μL
總量 16μL N×16μL
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm 離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入16μL，向每管中加處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照(HCOV/HBocaV-PTC)4μL，10000rpm 瞬時離心10 秒。
7.2 qRT-PCR反應條件
將各反應管放入實時熒光PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
反轉錄(Reverse Transcription) 1循環(huán) 50℃ for 30 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 5 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 10 sec
55℃ for 45 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM和VIC(若儀器無VIC通道，可選擇HEX或JOE通道)。其中FAM基團檢測HCOV，VIC/HEX/JOE基團檢測HBocaV。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

八、結果分析：
8.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
8.2 試驗成立判定
(1) 陰性對照(NTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道均無擴增。
(2) 陽性對照(HCOV/HBocaV-PTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道均有擴增。
以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效
8.3 結果判定
(1) FAM通道：Ct值≤35HCOV核酸為陽性；Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明HCOV核酸陰性。
Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進行重復試驗。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明HCOV核酸陽性；否則判為樣本陰性。
(2) VIC/HEX/JOE通道：Ct值≤35 HBocaV核酸為陽性；Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明HBocaV核酸陰性。Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進行重復試驗。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明HBocaV核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
(1) 初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
(2) 所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA 酶。
(3) PCR 操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR 擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
(4) 樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行，以免污染。
(5) 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。


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本試劑盒用一對偏肺病毒型特異性引物，一對博卡病毒型特異性引物，分別結合一條特異性熒光探針，用一步法雙重熒光RT-PCR 技術對偏肺病毒/博卡病毒RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。本試劑盒中偏肺病毒型的探針報告基團為FAM，博卡病毒型的探針報告基團為VIC/HEX/JOE。

試劑盒組成：

組份	數量	規(guī)格
偏肺病毒/博卡病毒反應液(HMPV/HBocaV-qRT-PCR MIX)	1管	576μL/管
qRT酶混合物(qRT Enzymes MIX)	1管	192μL/管
無核酸酶水(Nuclease-Free Water)	1管	500μL/管
陰性對照(NTC)	1管	50μL/管
偏肺病毒/博卡病毒陽性對照(HMPV/HBocaV-PTC)	1管	50μL/管

儲存條件：-20℃以下，有效期6個月。

使用方法：

一、樣品采集：
按照相關標準采集。標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-80℃，但不能超過6個月，標本運送應采用0℃冰壺。
?血清：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入無菌的干燥玻璃管，室溫(22-25℃)放置30-60min，血標本可自發(fā)完成凝集析出血清，或直接使用水平離心機，3000rpm離心5min，吸取上層血清，轉移至1.5mL滅菌離心管。
?血漿：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二鈉)或檸檬酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，5-10min后即可分離出血漿，轉移至1.5mL滅菌離心管。
?拭子、分泌物等樣品：在裝有拭子或分泌物的離心管中加入500μL PBS或生理鹽水，劇烈振蕩30s。棉拭子盡量擠出液體轉移到無RNA酶污染的離心管中，6000rpm離心20s，取上清備用。
?病灶組織樣品：稱取組織約0.1g于研磨器或組織勻漿器中研磨(zuì好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理鹽水研磨至無塊狀物，然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液于1.5mL滅菌離心管中。

二、RNA提取：
可采購北京百奧萊博科技有限公司生產的RNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
 注：陽性對照和陰性對照為已經抽提好的核酸(無需提取)，直接取4μL 加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。

三、檢測步驟：
1．試劑的準備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR 反應液(HMPV/HBocaV-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm 離心10s。
設所需要的PCR 反應管管數為N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：

試劑	每個反應加入的量	N個反應加入的量
熒光PCR反應液	12μL	N×12μL
酶混合物	4μL	N×4μL
總量	16μL	N×16μL

計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm 離心10s，向設定的N 個PCR 反應管中分別加入16μL，向每管中加入處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照(HMPV/HBocaV-PTC)4μL，10000rpm 瞬時離心10 秒。
2．qPCR反應條件
將各反應管放入實時熒光PCR儀器的反應槽內。推薦循環(huán)條件：

	反轉錄(Reverse Transcription)	1循環(huán)	50℃ for 30 min
預變性	1循環(huán)	95℃ for 5 min
PCR擴增	40循環(huán)	95℃ for 10 sec 55℃ for 45 sec

在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM和VIC(若儀器無VIC通道，可選擇HEX或JOE通道)。其中FAM基團檢測HMPV，VIC/HEX/JOE基團檢測HBocaV。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

四、結果分析：
1．結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。基線和閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zuì高點為準。
2．試驗成立判定
?陰性對照(NTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道均無擴增。
?陽性對照(HMPV/HBocaV-PTC)：FAM和VIC/HEX/JOE通道均有擴增。
?以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效
3．結果判定
?FAM通道：Ct值≤35HMPV核酸為陽性；Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明HMPV核酸陰性。
Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進行重復試驗。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明HMPV核酸陽性；否則判為樣本陰性。
?VIC/HEX/JOE通道：Ct值≤35 HBocaV核酸為陽性；Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明HBocaV核酸陰性。Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進行重復試驗。如果重復擴增曲線為對數擴增曲線，判為樣本陽性，表明HBocaV核酸陽性；否則判為樣本陰性。

五、注意事項：
?初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
?所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA 酶。
?PCR 操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR 擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
?樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行，以免污染。
?試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

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