His標簽蛋白純化樹脂由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品僅用于生物化學研究方面，我公司專注于蛋白質研究產品的研發、生產和供應，為您提供的His標簽蛋白純化樹脂質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產品。...

特別提示：包括His標簽蛋白純化樹脂在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：His標簽蛋白純化樹脂
英文名稱：Ni-NTA Resin
產品貨號：MT0081
產品規格：20ml

本制品是用于純化6xHis標簽重組蛋白的一種純化介質，它是由4%交聯的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得. Ni-NTA樹脂用于在非變性或變性條件下純化任何表達系統表達的6×His標簽重組蛋白。NTA，含有四個螯合區，較一般的三齒螯合劑能更好的結合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合，從而使His標簽蛋白結合在Ni-NTA純化介質上，未結合的蛋白被洗滌下去，結合在介質上的蛋白經過一定濃度的咪唑或低PH緩沖液被溫和的洗脫下來，從而得到高純度的目的蛋白。



產品特點：
1．該純化介質與His標簽蛋白具有高的親和力，可達5～20mg/ml。
2．可在非變性和變性條件下純化任何表達系統所得的His標簽蛋白。
3．純化程序簡單，所得的蛋白純度可高達95％。
4．Ni-NTA Resin可再生4～6次，重復使用。

產品應用：
1．His標簽蛋白的純化。
2．蛋白結構與功能研究。
3．蛋白-蛋白以及蛋白-DNA之間相互作用的研究。
4．配體-受體之間相互作用的研究。

應用實例：

PET28a系統于BL21(DE3)中誘導表達蛋白。M:中分子量蛋白Marker（MT0073），泳道1-5分別為：未誘導全菌蛋白，加IPTG誘導全菌蛋白，過柱液，洗滌液，洗脫液。

保存條件：4℃保存，切勿凍存。

操作方法：

A．非變性條件下抽提His標簽蛋白：

1. 樣品準備：
1) 準備細胞，接種，誘導表達。對于實驗室用的pET 載體表達系列，在細胞OD600=0.5～0.8時，用1mM IPTG誘導1-3小時，可以獲得理想的表達效率。收集細胞，置于-70℃或立即進行步驟2操作。
2) 加入1/20細胞生長體積的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl,10% Glycerol)和 1mM PMSF。
  注意：PMSF 見水分解，需要在使用前加入。
3) 將細胞懸浮起來，超聲或勻漿破碎細胞。該步驟冰上操作。
4) 加入10% Triton X-100, 使終濃度為 0.05%，充分混勻，冰上放置15分鐘。
5) 13000轉/分(20000g以上)，4℃離心15分鐘。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

2．層析：
1) 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用10 倍 NTA 體積的NTA-0 Buffer 平衡填料。
2) 將上清樣品加至 NTA 層析柱中，流速在15ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質的結合情況。
3) 層析用5 倍 NTA 體積的NTA-0 Buffer 洗滌填料，流速控制在30ml/h 左右。
4)再分別用5 倍 NTA 體積的NTA-20、NTA-50、NTA-100、NTA-250 洗脫填料，流速控制在15ml/h 左右，收集洗脫液，每管收集一個 NTA 體積。
5) 確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。zuì為有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用Bradford 蛋白質測定試劑盒，快速確定蛋白質的含量，然后用SDS/PAGE 分析蛋白質的分布。
6) 目標蛋白質需要進一步純化需要根據蛋白質的用途確定。純化的目標蛋白質的保存條件需要根據蛋白質的性質和用途確定。

3．溶液配方：
NTA-0 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol
NTA-20 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,20mM Imidazole(咪唑)
NTA-50 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,50mM Imidazole(咪唑)
NTA-100 Buffer：20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,100mM Imidazole(咪唑)
NTA-250 Buffer：20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,250mM Imidazole(咪唑)

B．變性條件下從包涵體中純化His標簽蛋白：

1．樣品準備：
1) 準備細胞，接種，誘導表達。對于實驗室用的pET 載體表達系列，在細胞 OD600=0.5～0.8時，用1 mM IPTG誘導1～3小時，可以獲得理想的表達效率。收集細胞，置于-70℃或立即進行步驟2 操作。
2) 加入1/20細胞生長體積的GuNTA-0 Buffer和1mM PMSF。
  PMSF見水分解，需要在使用前加入。
3) 將細胞懸浮起來，冰上超聲破碎細胞。
4) 室溫放置30分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。
5) 13000轉/分，4℃離心15分鐘。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

2．層析：
1) 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。
2) 將樣品加到NTA層析柱中，流速控制在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質的結合情況。
3) 層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/h 左右。
4) 分別用5倍NTA體積GuNTA-20、GuNTA-50、GuNTA-100、GuNTA-250洗脫，流速在15ml/h左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。
5) 確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。zuì為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford蛋白質測定試劑盒，快速確定蛋白質的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質的分布。
6) 目標蛋白質需要進一步純化需要根據蛋白質的用途確定。
7) 純化的目標蛋白質需要復性，復性常用的手段可以參考有關手冊確定的原則，根據蛋白質的特性來摸索具體的方案。

3．溶液配方：
GuNTA-0 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl
GuNTA-20 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl,20mM Imidazole
GuNTA-50 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl,50mM Imidazole
GuNTA-100 Buffer：20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl,100mM Imidazole
GuNTA-250 Buffer：20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl,250mM Imidazole

附：NTA樹脂的再生
NTA樹脂在使用若干次數(3～5次)后，結合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹脂的使用壽命和蛋白質的結合效率。NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計出NTA的樹脂體積，按下列次序將再生試劑加到層析柱里，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。用戶需要自行準備25%、50%、75%、(v/v)乙醇和去離子水。

NTA再生步驟：
1) 從層析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA樹脂體積的Stripping Solution I洗。
2) 用2倍體積的去離子水洗。
3) 用3倍體積的Stripping Solution II洗。
4) 用1倍體積的25%乙醇洗。
5) 用1倍體積的50%乙醇洗。
6) 用1倍體積的75%乙醇洗。
7) 用5倍體積的乙醇洗。
8) 用1倍體積的75%乙醇洗。
9) 用1倍體積的50%乙醇洗。
10) 用1倍體積的25%乙醇洗。
11) 用1倍體積的去離子水洗。
12) 用5倍體積的Stripping Solution III洗。
13) 用3倍體積的去離子水洗。
14) 如果立即使用，用5倍體積的Ni Charging Solution洗，再用10倍體積的平衡溶液(NTA-0 Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗。
15) 如果想長期儲存，加入1倍體積的20%乙醇，4℃保存，使用前需要執行步驟14。

Stripping Solution I：6M GuHCl, 0.2M acetic acid
Stripping Solution II：2% SDS
Stripping Solution III：100mM EDTA(pH8.0)
Ni Charging Solution：100mM NiSO4

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