ZN1523 敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅴ
- 產品/服務：ZN1523 敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅴ
- 型 號：ZN1523
- 品 牌：百奧萊博
- 單 價：面議
- 更新日期：2023-05-23
- 有效期至：長期有效
- 瀏覽次數：1065
產品簡介
敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅴ由專業試劑供應商北京百奧萊博提供，用于科研目的，本品質量穩定，價位合理，需要敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅴ等探針標記及檢測產品的客戶，請到我公司官網聯系我們。...
產品詳細介紹
特別提示：包括敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅴ(FITC)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！
產品名稱：敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅴ(FITC)
產品貨號：ZN1523
產品規格：100T
保存：置4℃。
工作量：100 張切片。
有效期：一年。
所謂原位雜交是指借助于核酸分子雜交的方法，在顯微鏡水平檢測和定位特異的核苷酸片段。現在原位雜交已成為在分子水平研究腫瘤和遺傳性疾病的發生，發展和調控等根本性問題的有力工具，其作用是免疫組化所無法代替的。具有敏感性特高，操作簡便和結果準確的優點。該試劑盒用于 mRNA的雜交，不推薦使用每個探針分子僅標記一個地gāo辛的寡核苷酸探針。
如果使用 cDNA 探針，應在雜交之前變性探針。
試劑盒中內容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2．預雜交液 2ml；
3.寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml;
5.生物素化鼠抗地gāo辛 5ml;
6．SABC-FITC 100ul(1:100)
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,0.5M PBS)
一．培養細胞和冰凍切片
準備工作：緩沖液的配備
3%檸檬酸——100ml 蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7·H2O)3g,pH2.0 左右。
2×SSC——1000ml 蒸餾水中加氯化鈉 17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3·2H2O，分子量 294)8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸餾水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸餾水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸餾水即可。
0.5 M PBS——1000ml 蒸餾水加氯化鈉 30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入 0.1%的DEPC 處理，以抑制 RNA酶對 mRNA的分解作用.
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度 10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和 5%的CO2，所用培養基為Dulbecco 基礎培養基。細胞長好后 0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS，含有 1/1000 DEPC。
室溫固 定 20--30分鐘。蒸餾水洗，干燥后可-20℃冰凍保存 2 周。
4．暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加 2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化 5—120 秒鐘。有時也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
5．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持濕度。按每張切片 20μl加預雜交液。恒溫箱 37-40℃2—4 小時。吸取多余液體，不洗。
6．雜交——用雜交液稀釋地gāo辛標記的寡核苷酸探針，濃度一般 0.5-2μg/ml。按每張切片加 20μ ι 雜交液。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱 37—40℃雜交過夜。
7．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，30—37℃左右水溫的2×SSC洗滌 5分鐘×2次；0.5×SSC洗滌15分鐘×1次；0.2×SSC洗滌 15分鐘×1次。必要時可重復 0.2×SSC洗滌 1次。
8.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
9.滴加生物素化鼠抗地gāo辛：37℃60或室溫 120分鐘。0.5M PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
10．滴加 SABC-FITC：取 1ul SABC –FITC 加原位雜交用 PBS 100ul,每張切片加 50ul 37℃ 30分鐘。0.5M PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
11．用水溶性封片劑或抗熒光衰減封片劑 封片后，熒光顯微鏡觀察。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 MPBS，含有 1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過 4mm的小塊，固定 1 小時即可，較大的標本固定不要超過 2 小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一定不要超過 1 小時。
1．常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度 6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片常規脫蠟至水。
4．暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加 2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化 3--30分鐘(視標本厚薄、新舊自行調整)。充分的消化可以使 mRNA 得到暴露，從而增強雜交信號；但另一方面，過度的消化又使切片明顯減薄乃至消失，從而失去雜交信號。由于用戶的切片情況各不相同，這就需要用戶比較不同的消化時間，例如 10分鐘，20分鐘，30分鐘，以找到zuì佳的消化時間。0.5M PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
其余步驟和冰凍切片 5-11 步相同。
結果觀察：
陽性細胞的胞漿著色呈黃綠色熒光。
注意事項：
如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。有其它明顯的非特異性染色現象時，可以用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—5倍。
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名稱：TdT加尾法DNA生物素標記試劑盒
貨號：BTN90605B
規格：5次
本試劑盒是基于TdT末端轉移酶能夠在DNA的3′端添加dNTP尾巴的原理而設計，該反應的示意圖如下：
產品特點：
1.快速，15分鐘即可完成標記反應。
2. 不但可用于單鏈DNA和DNA Oligo標記，還可用于3′突出的雙鏈DNA標記，但后者標記效率稍低。
3.可用同位素底物和非同位素底物(生物素和地gāo辛標記的核苷酸等)。
4. 提供不帶標記核苷酸、帶生物素標記核苷酸和帶地gāo辛標記核苷酸三種選擇。
5. 同時提供非標記的dATP，用戶可以用其調節加尾長短和標記核苷酸摻入比例。
6. 標記的探針可用于電泳遷移率實驗(EMSA)、原位雜交(ISH)、Northern Blot(不推薦用于低豐度RNA檢測)、小RNA Northern、Southern Blot(不推薦用于單拷貝基因檢測)、菌落雜交、斑點印跡雜交分析等。
試劑盒組成：
| 成分 | 規格 |
| TdT緩沖液，5× | 20μl |
| TdT(末端轉移酶，10U/μL) | 10μl |
| dATP，2mM | 5μl |
| 標記核苷酸 | (A、B、C不同，見注) |
| 超純水 | 1ml |
| 說明書 | 1份 |
注：A型用于自選標記，用戶需自備標記核苷酸，本產品不提供標記核苷酸；B型提供5μl Biotin-11-dUTP；C型提供含5μl DIG-11-dUTP。
儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。
使用方法：
1.在0.2mL微量離心管中按下表設置一個20μl體系的標記反應(如果需要標記更多探針，請增加標記體積而不要增加探針DNA的濃度)：
| 成份 | 用量 |
| 探針DNA | 100-200 pmol |
| TdT Buffer，5× | 4μl |
|
標記核苷酸，1mM (A型需自備標記核苷酸) | 1μl |
| dATP，2mM | (見下注) |
| TdT末端轉移酶(10U/μL) | 2μl |
| 超純水 | 補到20μl |
注：dATP可以不加，但這樣得到的加尾全部是標記核苷酸，由于空間阻礙，靈敏度不一定zuì佳。如果雜交效果不好，摻入一定比例的dATP到標記核苷酸中，以控制標記的密度，提高比活。具體比例如何可以自己優化。
2. 37℃反應15分鐘，延長到30分鐘也可以。如果沒有非標記核苷酸存在，一般可以加尾3-5個Biotin或DIG標記的核苷酸(標記物空間阻礙抑制延長)；如果有在加尾反應中加入一定比例的非標記核苷酸dATP(其他dNTP也可，只是本試劑盒只提供dATP而已)，每條探針上可加上約100個核苷酸，平均含5個標記核苷酸
3. 70℃ 10分鐘滅活TdT酶。
4. 如果需要，可以PAGE電泳+銀染(相關試劑需要另購)檢測標記效率，帶標記的探針泳動速度將低于沒標記的探針。
5. 如果是非同位素標記，探針不需純化可以直接用于雜交。如果需要純化非同位素標記的探針，請不要酚/氯fǎng抽提，因為非同位素標記物一般會使探針DNA進入有機相而丟失。
6. 使用時需將探針以1-8 ng/μL的終濃度加入到雜交液中(如果探針是雙鏈DNA，加入前還需熱變性)。如果不立即使用，非同位素標記的探針DNA可-20℃長期放置一年，同位素標記的探針DNA不能放置。
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